Hvala što ste posjetili www.chinacdoe.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Sustavi laboratorija na čipu s mogućnostima na licu mjesta nude potencijal za brzu i točnu dijagnozu i korisni su u okruženjima s ograničenim resursima gdje nisu dostupni biomedicinska oprema i obučeni stručnjaci.Međutim, stvaranje sustava za testiranje na mjestu skrbi koji istovremeno ima sve potrebne značajke za višenamjensko doziranje, puštanje na zahtjev, pouzdane performanse i dugotrajno skladištenje reagensa ostaje veliki izazov.Ovdje opisujemo tehnologiju mikro pokretnog prekidača koja se pokreće polugom koja može manipulirati tekućinama u bilo kojem smjeru, pružiti precizan i proporcionalan odgovor na primijenjeni tlak zraka i ostati stabilan protiv naglih pokreta i vibracija.Na temelju tehnologije, također opisujemo razvoj sustava lančane reakcije polimeraze koji integrira funkcije uvođenja reagensa, miješanja i reakcije u jednom procesu, čime se postiže izvedba "uzorak-u-odgovor-izlazak" za sve kliničke nazalne uzorke od 18 pacijenata s Influenca i 18 pojedinačnih kontrola, u dobroj podudarnosti intenziteta fluorescencije sa standardnom lančanom reakcijom polimerazom (Pearsonov koeficijent > 0,9).Na temelju tehnologije, također opisujemo razvoj sustava lančane reakcije polimeraze koji integrira funkcije uvođenja reagensa, miješanja i reakcije u jednom procesu, čime se postiže izvedba "uzorak-u-odgovor-izlaz" za sve kliničke nazalne uzorke od 18 pacijenata s gripom i 18 pojedinačnih kontrola, u dobroj podudarnosti intenziteta fluorescencije sa standardnom lančanom reakcijom polimeraze (Pearsonov koeficijent > 0,9).Temeljimo se na ovoj tehnologiji, također opisujemo razradu sustava polimerazne reakcije, koja objedinjuje funkcije unosa reagensa, miješanja i reakcija u jednom procesu, što osigurava izvođenje «obrazca-v-odgovor-izhod» za sve kliničke uzorke iz nosa 18 pacijenata s Grippom i 18 pojedinačnih kontrola, u dobrom skladu s intenzitetom fluorescencije sa standardnom polimeraznom cepnom reakcijom (Pirsonov koeficijent> 0,9).Na temelju ove tehnologije, također opisujemo razvoj sustava lančane reakcije polimeraze koji kombinira funkcije ubrizgavanja, miješanja i reakcije u jednom procesu, omogućavajući uzimanje uzoraka u odgovoru za sve kliničke nazalne uzorke od 18 pacijenata s gripom.i 18 pojedinačnih kontrola, u dobrom skladu sa standardnim intenzitetom fluorescencije lančane reakcije polimeraze (Pearsonov koeficijent > 0,9).Na temelju ove tehnologije također opisujemo razvoj sustava lančane reakcije polimeraze koji integrira funkcije ubrizgavanja reagensa, miješanja i reakcije za analizu svih kliničkih nazalnih uzoraka iz 18 uzoraka nazalnih pacijenata u uzorku. Influenca i 18 pojedinačnih kontrola, intenzitet fluorescencije usklađen dobro sa standardnom lančanom reakcijom polimerazom (Pearsonov koeficijent > 0,9).Predložena platforma jamči pouzdanu automatizaciju biomedicinske analize i tako može ubrzati komercijalizaciju niza uređaja za testiranje na mjestu skrbi.
Nove ljudske bolesti, kao što je pandemija COVID-19 2020. koja je odnijela živote milijuna ljudi, predstavljaju ozbiljnu prijetnju globalnom zdravlju i ljudskoj civilizaciji1.Rano, brzo i točno otkrivanje bolesti ključno je za kontrolu širenja virusa i poboljšanje ishoda liječenja.Osnovni dijagnostički ekosustav temeljen na centraliziranim laboratorijima u kojima se testni uzorci šalju u bolnice ili dijagnostičke klinike i kojima upravljaju profesionalci trenutno ograničava pristup za gotovo 5,8 milijardi ljudi diljem svijeta, posebno onih koji žive u okruženjima s ograničenim resursima.gdje nedostaje skupe biomedicinske opreme i kvalificiranih stručnjaka.kliničari 2. Stoga postoji hitna potreba za razvojem jeftinog i korisniku jednostavnog sustava laboratorija na čipu s mogućnošću testiranja na mjestu skrbi (POCT) koji kliničarima može pružiti pravovremene dijagnostičke informacije za donošenje informiranih odluka o dijagnozi .i liječenje 3.
Smjernice Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) navode da bi idealan POCT trebao biti pristupačan, jednostavan za korištenje (jednostavan za korištenje uz minimalnu obuku), precizan (izbjegavati lažno negativne ili lažno pozitivne), brz i pouzdan (pružati dobra svojstva ponovljivosti) i isporučiv (sposoban za dugoročno skladištenje i lako dostupan krajnjim korisnicima)4.Kako bi ispunili ove zahtjeve, POCT sustavi moraju osigurati sljedeće značajke: svestrano doziranje kako bi se smanjila ručna intervencija, otpuštanje reagensa na zahtjev prema mjerilu za točne rezultate testa i pouzdane performanse koje izdržavaju vibracije iz okoline.Trenutno, najčešće korišteni POCT uređaj je lateral flow strip5,6 koji se sastoji od nekoliko slojeva poroznih nitroceluloznih membrana koje guraju vrlo malu količinu uzorka naprijed, reagirajući s prethodno imobiliziranim reagensima kapilarnom silom.Iako imaju prednost niske cijene, jednostavnosti upotrebe i brzih rezultata, POCT uređaji temeljeni na protočnim trakama mogu se koristiti samo za biološke testove (npr. testovi glukoze7,8 i testovi trudnoće9,10) bez potrebe za višestupanjskom analizom.reakcije (npr. punjenje višestrukih reagensa, miješanje, multipleksiranje).Osim toga, pokretačke sile koje kontroliraju kretanje tekućine (tj. kapilarne sile) ne osiguravaju dobru konzistentnost, osobito između serija, što rezultira slabom reproducibilnošću11 i čineći trake bočnog protoka prvenstveno korisnima za dobro otkrivanje12,13.
Proširene proizvodne mogućnosti na mikro i nano razini stvorile su prilike za razvoj mikrofluidnih POCT uređaja za kvantitativna mjerenja14,15,16,17.Podešavanjem svojstava sučelja 18, 19 i geometrije kanala 20, 21, 22, može se kontrolirati kapilarna sila i brzina protoka ovih uređaja.Međutim, njihova pouzdanost, posebno za jako namočene tekućine, ostaje neprihvatljiva zbog netočnosti u proizvodnji, nedostataka materijala i osjetljivosti na vibracije iz okoline.Osim toga, budući da se kapilarni protok stvara na granici tekućina-plin, ne može se uvesti dodatni protok, posebno nakon punjenja mikrofluidnog kanala tekućinom.Stoga je za složeniju detekciju potrebno provesti nekoliko koraka ubrizgavanja uzorka24,25.
Među mikrofluidnim uređajima, centrifugalni mikrofluidički uređaji trenutno su jedno od najboljih rješenja za POCT26,27.Njegov pogonski mehanizam ima prednost jer se pogonska sila može kontrolirati podešavanjem brzine vrtnje.Međutim, nedostatak je to što je centrifugalna sila uvijek usmjerena prema vanjskom rubu uređaja, što otežava provedbu reakcija u više koraka potrebnih za složenije analize.Iako su dodatne pogonske sile (npr. kapilare 28, 29 i mnoge druge 30, 31, 32, 33, 34, 35) pored centrifugalne sile uvedene za višenamjensko doziranje, još uvijek može doći do nepredviđenog prijenosa tekućine jer su te dodatne sile općenito naredbe magnitude niže od centrifugalne sile, što ih čini učinkovitima samo u malim radnim rasponima ili nisu dostupni na zahtjev s otpuštanjem tekućine.Uključivanje pneumatskih manipulacija u centrifugalnu mikrofluidiku kao što su centrifugalne kinetičke metode 36, 37, 38, termopneumatske metode 39 i aktivne pneumatske metode 40 pokazalo se atraktivnom alternativom.Uz protufugodinamički pristup, dodatna šupljina i spojni mikrokanali integrirani su u uređaj za vanjsko i unutarnje djelovanje, iako njegova učinkovitost pumpanja (u rasponu od 75% do 90%) uvelike ovisi o broju ciklusa pumpanja i viskoznosti tekućine.U termopneumatskoj metodi, membrana od lateksa i komora za prijenos tekućine posebno su dizajnirane za brtvljenje ili ponovno otvaranje ulaza kada se zarobljeni volumen zraka zagrijava ili hladi.Međutim, postavka grijanja/hlađenja uvodi probleme sa sporim odgovorom i ograničava njegovu upotrebu u termoosjetljivim testovima (npr. pojačanje lančane reakcije polimerazom (PCR).S aktivnim pneumatskim pristupom, otpuštanje na zahtjev i kretanje prema unutra postižu se istovremenom primjenom pozitivnog tlaka i precizno prilagođenih brzina vrtnje pomoću motora velike brzine.Postoje i drugi uspješni pristupi koji koriste samo pneumatske aktuatore (pozitivan tlak 41, 42 ili negativan tlak 43) i dizajn normalno zatvorenih ventila.Uzastopnim primjenom tlaka u pneumatskoj komori, tekućina se peristaltički pumpa prema naprijed, a normalno zatvoreni ventil sprječava povratni tok tekućine uslijed peristaltike, čime se ostvaruju složene tekućinske operacije.Međutim, trenutačno postoji samo ograničen broj mikrofluidnih tehnologija koje mogu izvoditi složene tekućinske operacije u jednom POCT uređaju, uključujući višenamjensko doziranje, otpuštanje na zahtjev, pouzdan rad, dugotrajno skladištenje, rukovanje tekućinama visoke viskoznosti, i troškovno učinkovitu proizvodnju.Sve u isto vrijeme.Nedostatak funkcionalne operacije u više koraka također može biti jedan od razloga zašto je samo nekoliko komercijalnih POCT proizvoda kao što su Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat i Rhonda do danas uspješno predstavljeno na otvorenom tržištu.
U ovom radu predlažemo pneumatski mikrofluidni aktuator temeljen na tehnologiji mikrosklopke zelenog prstena (FAST).FAST kombinira sva potrebna svojstva u isto vrijeme za širok raspon reagensa od mikrolitara do mililitara.FAST se sastoji od elastičnih membrana, poluga i blokova.Bez primjene zračnog tlaka, membrane, poluge i blokovi mogu se čvrsto zatvoriti, a tekućina unutar može se pohraniti dulje vrijeme.Kada se primijeni odgovarajući pritisak i prilagodi duljini poluge, dijafragma se širi i gura polugu u otvoreni položaj, dopuštajući tekućini da prođe.To omogućuje višenamjensko mjerenje tekućina na kaskadni, simultani, sekvencijalni ili selektivni način.
Razvili smo PCR sustav koji koristi FAST za generiranje rezultata odgovora u uzorku za detekciju virusa influence A i B (IAV i IBV).Postigli smo donju granicu detekcije (LOD) od 102 kopije/mL, naš multipleksni test pokazao je specifičnost za IAV i IBV i omogućio patotipizaciju virusa influence.Rezultati kliničkog testiranja na uzorku brisa nosa od 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazuju dobru podudarnost intenziteta fluorescencije sa standardnom RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).Rezultati kliničkog testiranja na uzorku brisa nosa od 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazuju dobru podudarnost intenziteta fluorescencije sa standardnom RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).Rezultati kliničkih ispitivanja s uzorkom mazke iz nosa kod 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazuju dobru usklađenost intenziteta standardne fluorescencije OT-PCR (Pirsonov koeficijent > 0,9).Rezultati kliničkih ispitivanja na uzorku brisa nosa od 18 pacijenata i 18 zdravih pojedinaca pokazuju dobro slaganje između intenziteta fluorescencije standardne RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).0,9)..................... Rezultati kliničkih ispitivanja s uzorcima nazalnih maza na 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazali su dobar odnos između intenziteta fluorescencije i standardnog OT-PCR (Pirsonov koeficijent > 0,9).Rezultati kliničkih ispitivanja u kojima su korišteni uzorci brisa nosa 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazali su dobro slaganje između intenziteta fluorescencije i standardne RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).Procijenjeni trošak materijala za FAST-POCT uređaj je približno 1 USD (dodatna tablica 1) i može se dodatno smanjiti korištenjem proizvodnih metoda velikih razmjera (npr. injekcijsko prešanje).Zapravo, POCT uređaji koji se temelje na FAST-u imaju sve potrebne značajke propisane od strane WHO-a i kompatibilni su s novim metodama biokemijskog testiranja kao što su termalni ciklus plazme44, imunotestovi bez amplifikacije45 i testovi funkcionalizacije nanotijela46 koji su okosnica POCT sustava.mogućnost.
Na sl.Slika 1a prikazuje strukturu FAST-POCT platforme koja se sastoji od četiri komore za tekućinu: komora za predskladištenje, komora za miješanje, reakcijska komora i komora za otpad.Ključ za kontrolu protoka tekućine je FAST dizajn (koji se sastoji od elastičnih membrana, poluga i blokova) smješten u komori za predskladištenje i komori za miješanje.Kao pneumatski pokretana metoda, FAST dizajn pruža preciznu kontrolu protoka tekućine, uključujući zatvoreno/otvoreno prebacivanje, svestrano doziranje, otpuštanje tekućine na zahtjev, pouzdan rad (npr. neosjetljivost na vibracije iz okoline) i dugotrajno skladištenje.Platforma FAST-POCT sastoji se od četiri sloja: potpornog sloja, sloja elastičnog filma, sloja plastičnog filma i pokrovnog sloja, kao što je prikazano u uvećanom prikazu na slici 1b (također detaljno prikazano na dodatnim slikama S1 i S2). ).Svi kanali i komore za transport tekućine (kao što su komore za predskladištenje i reakcijske komore) ugrađene su u PLA (polimliječna kiselina) supstrate debljine od 0,2 mm (najtanji dio) do 5 mm.Elastični filmski materijal je PDMS debljine 300 µm koji se lako širi kada se primijeni tlak zraka zbog svoje "tanke debljine" i niskog modula elastičnosti (oko 2,25 MPa47).Sloj polietilenskog filma izrađen je od polietilen tereftalata (PET) debljine 100 µm kako bi se zaštitio elastični film od prekomjerne deformacije uslijed tlaka zraka.U skladu s komorama, sloj supstrata ima poluge povezane s pokrovnim slojem (napravljenim od PLA) šarkama za kontrolu protoka tekućine.Elastični film je zalijepljen na pozadinski sloj pomoću dvostrano ljepljive trake (ARseal 90880) i prekriven plastičnim filmom.Tri sloja su sastavljena na supstratu korištenjem dizajna T-kopče u pokrovnom sloju.T-stezaljka ima razmak između dvije noge.Kad je kopča umetnuta u utor, dvije su se noge lagano savile, a zatim su se vratile u prvobitno stanje i čvrsto vezale poklopac i podlogu dok su prolazile kroz utor (dodatna slika S1).Četiri sloja se zatim sastavljaju pomoću konektora.
Shematski dijagram platforme koji prikazuje različite funkcionalne odjeljke i značajke FAST-a.b Uvećani dijagram FAST-POCT platforme.c Fotografija platforme pored kovanice od četvrt dolara.
Radni mehanizam platforme FAST-POCT prikazan je na slici 2. Ključne komponente su blokovi na osnovnom sloju i šarke na pokrovnom sloju, što rezultira interferencijskim dizajnom kada su četiri sloja sastavljena pomoću T-oblika .Kada se ne primjenjuje pritisak zraka (sl. 2a), interferentni spoj uzrokuje savijanje i deformaciju zgloba, a sila brtvljenja se primjenjuje kroz polugu da pritisne elastični film na blok, a tekućina u brtvenoj šupljini definirana je kao zapečaćeno stanje.Treba primijetiti da je u ovom stanju poluga savijena prema van, kao što je prikazano u bočnom pogledu na slici 2a.Kada se dovede zrak (slika 2b), elastična membrana se širi prema van prema poklopcu i gura polugu prema gore, otvarajući tako razmak između poluge i bloka za protok tekućine u sljedeću komoru, što je definirano kao otvoreno stanje .Nakon otpuštanja pritiska zraka, poluga se može vratiti u prvobitni položaj i ostati zategnuta zahvaljujući elastičnosti šarke.Video zapisi pokreta poluge prikazani su u dodatnom filmu S1.
A. Shematski dijagram i fotografije kada su zatvoreni.U nedostatku pritiska, poluga pritišće membranu na blok, a tekućina je zapečaćena.b U dobrom stanju.Kada se primijeni pritisak, membrana se širi i gura polugu prema gore, tako da se kanal otvara i tekućina može teći.c Odredite karakterističnu veličinu kritičnog tlaka.Karakteristične dimenzije uključuju duljinu poluge (L), razmak između klizača i zgloba (l) i debljinu izbočine poluge (t).Fs je sila zbijanja u točki gasa B. q je jednoliko raspoređeno opterećenje na poluzi.Tx* predstavlja zakretni moment koji razvija zglobna poluga.Kritični tlak je tlak potreban da se podigne poluga i pokrene tekućina.d Teorijski i eksperimentalni rezultati odnosa između kritičnog tlaka i veličine elementa.Provedeno je n = 6 neovisnih eksperimenata i podaci su prikazani kao ± standardna devijacija.Neobrađeni podaci prikazuju se kao datoteke neobrađenih podataka.
Razvijen je analitički model temeljen na teoriji grede za analizu ovisnosti kritičnog tlaka Pc pri kojem se otvor otvara o geometrijskim parametrima (na primjer, L je duljina poluge, l je udaljenost između bloka i poluge). zglob, S je poluga Kontaktna površina s tekućinom t je debljina izbočine poluge, kao što je prikazano na slici 2c).Kao što je detaljno opisano u Dodatnim bilješkama i Dodatnoj slici S3, razmak se otvara kada \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), gdje je Fs zakretni moment \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) kako bi se eliminirale sile povezane s interferencijskim pristajanjem i uzrokovale savijanje šarke.Eksperimentalni odziv i analitički model pokazuju dobro slaganje (Sl. 2d), pokazujući da kritični tlak Pc raste s povećanjem t/l i smanjenjem L, što je lako objasniti klasičnim modelom grede, tj. zakretni moment raste s t /Lift .Dakle, naša teorijska analiza jasno pokazuje da se kritični tlak može učinkovito kontrolirati podešavanjem duljine poluge L i omjera t/l, što daje važnu osnovu za dizajn FAST-POCT platforme.
Platforma FAST-POCT pruža višenamjensko doziranje (prikazano na slici 3a s umetnutim i eksperimentom), što je najvažnija značajka uspješnog POCT-a, gdje tekućine mogu teći u bilo kojem smjeru i bilo kojim redoslijedom (kaskadno, istovremeno, sekvencijalno) ili selektivno višekanalno točenje .– funkcija doziranja.Na sl.Slika 3a(i) prikazuje kaskadni način doziranja u kojem su dvije ili više komora kaskadno povezane pomoću blokova za odvajanje različitih reaktanata i poluge za kontrolu otvorenog i zatvorenog stanja.Kada se primijeni pritisak, tekućina teče iz gornje u donju komoru na kaskadni način.Treba napomenuti da se kaskadne komore mogu puniti mokrim kemikalijama ili suhim kemikalijama kao što su liofilizirani prašci.U eksperimentu na slici 3a(i), crvena tinta iz gornje komore teče zajedno s prahom plave boje (bakrov sulfat) u drugu komoru i postaje tamnoplava kada stigne do donje komore.Također pokazuje kontrolni tlak za tekućinu koja se pumpa.Slično, kada je jedna poluga povezana s dvije komore, to postaje način istovremenog ubrizgavanja, kao što je prikazano na sl.3a(ii), u kojoj se tekućina može ravnomjerno rasporediti u dvije ili više komora kada se primijeni pritisak.Budući da kritični tlak ovisi o duljini poluge, duljina poluge može se prilagoditi kako bi se postigao sekvencijalni uzorak ubrizgavanja kao što je prikazano na sl.3a(iii).Duga poluga (s kritičnim tlakom Pc_long) bila je spojena na komoru B, a kratka poluga (s kritičnim tlakom Pc_short > Pc_long) bila je spojena na komoru A. Kako je primijenjen tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), samo je tekućina u crvenoj boji može teći u komoru B i kada je tlak povećan na P2 (> Pc_short), plava tekućina može teći u komoru A. Ovaj sekvencijalni način ubrizgavanja primjenjuje se na različite tekućine koje se redom prenose u svoje povezane komore, što je kritično za uspješan POCT uređaj.Duga poluga (s kritičnim tlakom Pc_long) bila je spojena na komoru B, a kratka poluga (s kritičnim tlakom Pc_short > Pc_long) bila je spojena na komoru A. Kako je primijenjen tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), samo je tekućina u crvenoj boji može teći u komoru B i kada je tlak povećan na P2 (> Pc_short), plava tekućina može teći u komoru A. Ovaj sekvencijalni način ubrizgavanja primjenjuje se na različite tekućine koje se redom prenose u svoje povezane komore, što je kritično za uspješan POCT uređaj.Dugi ring (s kritičnim pritiskom Pc_long) spojen je s kamerom B, kratki rychag (s kritičnim pritiskom Pc_short > Pc_long) spojen je s kamerom A. Pri priloženom pritisku P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) samo tekućina, istaknuta crvena može biti tečna u kameru B, i kada se pritisak povećao na P2 (> Pc_short), sinja tekućina može teći u kameri A. Ovaj režim postupnog unosa primjenjuje se na različite tekućine, koje se postupno premještaju u drugu kameru, što ima rješavajuće značenje za uspješan POCT.Duga poluga (s kritičnim tlakom Pc_long) bila je spojena na komoru B, a kratka poluga (s kritičnim tlakom Pc_short > Pc_long) bila je spojena na komoru A. Kada se primijeni tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), označena je samo tekućina crvenom bojom može teći u komoru B, a kada se tlak poveća na P2 (> Pc_short), plava tekućina može teći u komoru A. Ovaj način sekvencijalnog ubrizgavanja primjenjuje se na različite tekućine koje se sekvencijalno prenose u odgovarajuće komore, što je kritično za uspješan POCT.uređaj. Dugi ring (kritični pritisak Pc_long) spojen s kamerom B, kratki ring (kritični pritisak Pc_short > Pc_long) spojen s kamerom A.Dugi krak (kritični tlak Pc_long) povezan je s komorom B, a kratki krak (kritični tlak Pc_short > Pc_long) povezan je s komorom A.Pri priloženom pritisku P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) u kameri B može se postupiti samo crvena tekućina, a pri povećanom tlaku do P2 (> Pc_short) u kameri A može postupiti sinja tekućina.Kada se primijeni tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), samo crvena tekućina može ući u komoru B, a kada se tlak poveća na P2 (> Pc_short), plava tekućina može ući u komoru A. Ovaj način sekvencijalnog ubrizgavanja prikladan je za sekvencijalni prijenos različite tekućine u odgovarajuće komore, što je ključno za uspješan rad POCT uređaja.Slika 3a(iv) prikazuje način selektivnog ubrizgavanja, gdje je glavna komora imala kratku (s kritičnim tlakom Pc_short) i dugu polugu (s kritičnim tlakom Pc_long < Pc_short) koje su dodatno bile spojene na komoru A, odnosno komoru B na drugi zračni kanal spojen na komoru B. Da bi se tekućina najprije prenijela u komoru A, na uređaj su istodobno primijenjeni tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i P2 (P2 > P1) s P1 + P2 > Pc_short.Slika 3a(iv) prikazuje način selektivnog ubrizgavanja, gdje je glavna komora imala kratku (s kritičnim tlakom Pc_short) i dugu polugu (s kritičnim tlakom Pc_long < Pc_short) koje su dodatno bile spojene na komoru A, odnosno komoru B na drugi zračni kanal spojen na komoru B. Da bi se tekućina najprije prenijela u komoru A, na uređaj su istodobno primijenjeni tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i P2 (P2 > P1) s P1 + P2 > Pc_short.Na sl.3a(iv) prikazan je režim selektivnog pritiska, pri kojem je osnovna kamera imala kratki (s kritičnim pritiskom Pc_short) i dugi ryčag (s kritičnim pritiskom Pc_long < Pc_short), koji su dodatno povezani s kamerom A i kamerom B.Slika 3a(iv) prikazuje način selektivnog ubrizgavanja, u kojem je glavna komora imala kratku (s kritičnim tlakom Pc_short) i dugu polugu (s kritičnim tlakom Pc_long < Pc_short), koje su bile dodatno povezane s komorom A odnosno komorom B.na drugom zračnom kanalu, spojenom s kamerom B. Da bi se prvo promijenila tekućina u kameru A, uređaj je istovremeno prilagodio pritisak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i P2 (P2 > P1), gdje je P1 + P2 > Pc_short.na drugi zračni kanal povezan s komorom B. Za prvi prijenos tekućine u komoru A, tlakovi P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i P2 (P2 > P1) su istovremeno primijenjeni na uređaj, gdje je P1 + P2 > Pc_short. 3a(iv) prikazan režim selektivnog pritiska, kada osnovna kamera ima kratki pritisak (s kritičnim pritiskom Pc_short) i dugi pritisak (s kritičnim pritiskom Pc_long < Pc_short), spojen s kamerom A i kamerom B, odnosno, u dopuni s drugim zračnim kanalom, spojeno na sobe B.3a(iv) prikazuje način selektivnog ubrizgavanja kada glavna komora ima kratku osovinu (kritični tlak Pc_short) i dugu osovinu (kritični tlak Pc_long < Pc_short) povezanu s komorom A odnosno komorom B, te uz još jedan prolaz za zrak, povezan sa sobom B.Dakle, P2 sprječava ulazak tekućine u komoru B;u međuvremenu, ukupni tlak P1 + P2 premašio je kritični tlak za aktiviranje kraće poluge spojene na komoru A kako bi se omogućio protok tekućine u komoru A. Zatim, kada je trebalo ispuniti komoru B, trebamo samo primijeniti P1 (Pc_long < P1 < Pc_kratko) u glavnoj komori kako bi se aktivirala duga poluga i omogućilo tekućini da teče u komoru B. Može se jasno uočiti od vremena t = 3 s do 9 s da je tekućina u komori A ostala konstantna dok je u komori rasla B kada je primijenjen pritisak P1.u međuvremenu, ukupni tlak P1 + P2 premašio je kritični tlak za aktiviranje kraće poluge spojene na komoru A kako bi se omogućio protok tekućine u komoru A. Zatim, kada je trebalo ispuniti komoru B, trebamo samo primijeniti P1 (Pc_long < P1 < Pc_kratko) u glavnoj komori kako bi se aktivirala duga poluga i omogućilo tekućini da teče u komoru B. Može se jasno uočiti od vremena t = 3 s do 9 s da je tekućina u komori A ostala konstantna dok je u komori rasla B kada je primijenjen pritisak P1.Između toga, zajednički pritisak P1 + P2 povećao je kritični pritisak, kako bi se aktivirao kraći žičar, spojen s kamerom A, kako bi se omogućila tekućina u kameri A. Zatim, kada je potrebno zatvoriti kameru B, moramo samo primijeniti P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) u osnovnoj kameri, da aktivirate dugi ryčag i date tekućinu u kameru B. Moguće je jasno vidjeti da je u razdoblju od t = 3 s do 9 s tekućinom u kameri A ostala konstantna, u to vrijeme dok se u kameri povećavala.U međuvremenu, ukupni tlak P1 + P2 premašio je kritični tlak za aktiviranje kraće poluge spojene na komoru A kako bi omogućila tekućini da teče u komoru A. Zatim, kada se komora B treba napuniti, trebamo primijeniti samo P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) u glavnoj komori kako bi aktivirali dugu polugu i pustili tekućinu da teče u komoru B. Može se jasno uočiti da je između t = 3 s i 9 s tekućina u komori A ostala konstantna, dok je u komori porasla.B kada se primijeni pritisak P1.U isto vrijeme, ukupni tlak P1 + P2 premašuje kritični tlak, aktivirajući kraću polugu koja povezuje komoru A, dopuštajući fluidu da teče u komoru A.Kada dođe vrijeme za punjenje komore A, jednostavno primjenjujemo P1 u glavnu komoru i P2 u sekundarnu komoru.Na taj se način ponašanje protoka može selektivno mijenjati između kamera A i B. Ponašanje protoka četiriju višenamjenskih načina distribucije može se pronaći u dodatnom filmu S2.
a Ilustracija višenamjenske dodjele, tj. (i) kaskadne, (ii) simultane, (iii) sekvencijalne i (iv) selektivne dodjele.Krivulje predstavljaju tijek rada i parametre ova četiri načina distribucije.b Rezultati testova dugotrajnog skladištenja u deioniziranoj vodi i etanolu.n = 5 neovisnih eksperimenata je provedeno i podaci su prikazani kao ± sd c.Demonstracije ispitivanja stabilnosti kada su uređaj FAST i uređaj kapilarnog ventila (CV) bili u (i) statičkom i (ii) vibrirajućem stanju.(iii) Volumen u odnosu na vrijeme za FAST i CV uređaje na različitim kutnim frekvencijama.d Objavljivanje rezultata testiranja na zahtjev za (i) FAST uređaj i (ii) CV uređaj.(iii) Odnos između volumena i vremena za FAST i CV uređaje koji koriste način isprekidanog tlaka.Sve stupce mjerila, 1 cm.Neobrađeni podaci daju se kao datoteke neobrađenih podataka.
Dugoročno skladištenje reagensa još je jedna važna značajka uspješnog POCT uređaja koji će neobučenom osoblju omogućiti rukovanje s višestrukim reagensima.Iako su mnoge tehnologije pokazale svoj potencijal za dugotrajnu pohranu (npr. 35 mikrodozatora, 48 blister pakiranja i 49 stick pakiranja), potreban je namjenski odjeljak za primanje paketa, što povećava cijenu i složenost;nadalje, ovi mehanizmi skladištenja ne dopuštaju doziranje na zahtjev i rezultiraju rasipanjem reagensa zbog ostataka u pakiranju.Sposobnost dugotrajnog skladištenja potvrđena je provođenjem ubrzanog testa životnog vijeka pomoću CNC-strojno obrađenog PMMA materijala zbog njegove male hrapavosti i otpornosti na propuštanje plina (dodatna slika S5).Ispitni aparat je napunjen deioniziranom vodom (deionizirana voda) i 70% etanolom (simulirajući hlapljive reagense) na 65°C tijekom 9 dana.I deionizirana voda i etanol pohranjeni su pomoću aluminijske folije da se blokira pristup odozgo.Arrheniusova jednadžba i energija aktivacije prodora objavljeni u literaturi50,51 korišteni su za izračunavanje ekvivalenta u stvarnom vremenu.Na sl.Slika 3b prikazuje prosječne rezultate gubitka težine za 5 uzoraka pohranjenih na 65°C tijekom 9 dana, što je ekvivalentno 0,30% za deioniziranu vodu i 0,72% za 70% etanol tijekom 2 godine na 23°C.
Na sl.3c prikazuje ispitivanje vibracija.Budući da je kapilarni ventil (CV) najpopularnija metoda rukovanja tekućinom među postojećim uređajima POCT28,29, za usporedbu je korišten CV uređaj širine 300 µm i dubine 200 µm.Može se vidjeti da kada oba uređaja ostanu nepomična, tekućina u FAST-POCT platformi brtvi, a tekućina u CV uređaju se blokira zbog naglog širenja kanala, što smanjuje kapilarne sile.Međutim, kako se kutna frekvencija orbitalnog vibratora povećava, tekućina u platformi FAST-POCT ostaje zatvorena, ali tekućina u CV uređaju teče u donju komoru (vidi također Dodatni film S3).Ovo sugerira da deformabilne šarke platforme FAST-POCT mogu primijeniti jaku mehaničku silu na modul kako bi čvrsto zatvorile tekućinu u komori.Međutim, u CV uređajima tekućina se zadržava zbog ravnoteže između čvrste, zračne i tekuće faze, stvarajući nestabilnost, a vibracije mogu poremetiti ravnotežu i uzrokovati neočekivano ponašanje protoka.Prednost FAST-POCT platforme je u tome što pruža pouzdanu funkcionalnost i izbjegava kvarove u prisutnosti vibracija koje se obično javljaju tijekom isporuke i rada.
Još jedna važna značajka platforme FAST-POCT je njezino puštanje na zahtjev, što je ključni uvjet za kvantitativnu analizu.Na sl.3d uspoređuje izdanje na zahtjev platforme FAST-POCT i CV uređaja.Od fig.3d(iii) vidimo da FAST uređaj brzo reagira na signal pritiska.Kad je na FAST-POCT platformu primijenjen pritisak, tekućina je tekla, a kad je pritisak popustio, protok se odmah zaustavio (Sl. 3d(i)).Ova se radnja može objasniti brzim elastičnim vraćanjem šarke, koja pritišće polugu natrag na blok, zatvarajući komoru.Međutim, tekućina je nastavila teći u CV uređaju, što je na kraju rezultiralo neočekivanim volumenom tekućine od približno 100 µl nakon otpuštanja tlaka (Slika 3d(ii) i Dodatni film S4).To se može objasniti nestankom učinka kapilarnog pričvršćivanja nakon potpunog vlaženja CV-a nakon prve injekcije.
Sposobnost rukovanja tekućinama različite močivosti i viskoznosti u istom uređaju ostaje izazov za POCT aplikacije.Loša sposobnost vlaženja može dovesti do curenja ili drugog neočekivanog ponašanja protoka u kanalima, a pomoćna oprema kao što su vrtložne miješalice, centrifuge i filtri često su potrebni za pripremu visoko viskoznih tekućina 52 .Testirali smo odnos između kritičnog tlaka i svojstava tekućine (sa širokim rasponom močivosti i viskoznosti).Rezultati su prikazani u Tablici 1 i Video S5.Može se vidjeti da se tekućine različite močivosti i viskoznosti mogu zatvoriti u komoru, a kada se primijeni pritisak, čak i tekućine s viskoznošću do 5500 cP mogu se prenijeti u susjednu komoru, što omogućuje otkrivanje uzoraka s visokim viskoznost (tj. ispljuvak, vrlo viskozan uzorak koji se koristi za dijagnozu bolesti dišnog sustava).
Kombinacijom gore navedenih višenamjenskih uređaja za doziranje može se razviti širok raspon POCT uređaja temeljenih na FAST-u.Primjer je prikazan na slici 1. Postrojenje sadrži komoru za predskladištenje, komoru za miješanje, reakcijsku komoru i komoru za otpad.Reagensi se mogu pohraniti u komori za prethodno skladištenje dulje vrijeme, a zatim se ispuštaju u komoru za miješanje.S pravim tlakom, pomiješani reaktanti mogu se selektivno prenijeti u komoru za otpad ili reakcijsku komoru.
Budući da je PCR otkrivanje zlatni standard za otkrivanje patogena kao što su H1N1 i COVID-19 i uključuje više koraka reakcije, koristili smo FAST-POCT platformu za PCR otkrivanje kao aplikaciju.Na sl.Slika 4 prikazuje proces PCR testiranja pomoću FAST-POCT platforme.Najprije su reagens za eluiranje, reagens za magnetska mikrozrnca, otopina za ispiranje A i otopina za ispiranje W pipetirani u komore za prethodno skladištenje E, M, W1 i W2.Faze adsorpcije RNA prikazane su na sl.4a i su kako slijedi: (1) kada se primijeni tlak P1 (=0,26 bara), uzorak se pomiče u komoru M i ispušta u komoru za miješanje.(2) Tlak zraka P2 (= 0,12 bara) dovodi se kroz priključak A spojen na dno komore za miješanje.Iako su brojne metode miješanja pokazale svoj potencijal u miješanju tekućina na POCT platformama (npr. serpentinsko miješanje 53, nasumično miješanje 54 i šaržno miješanje 55), njihova učinkovitost i djelotvornost miješanja još uvijek nisu zadovoljavajuće.Usvaja metodu miješanja s mjehurićima, u kojoj se zrak uvodi na dno komore za miješanje kako bi se stvorili mjehurići u tekućini, nakon čega snažni vrtlog može postići potpuno miješanje u roku od nekoliko sekundi.Provedeni su pokusi miješanja mjehurića, a rezultati su prikazani na dodatnoj slici S6.Može se vidjeti da kada se primijeni tlak od 0,10 bara, potpuno miješanje traje oko 8 sekundi.Povećanjem tlaka na 0,20 bara, potpuno miješanje se postiže za oko 2 sekunde.Metode za izračun učinkovitosti miješanja prikazane su u odjeljku Metode.(3) Upotrijebite rubidijski magnet za ekstrahiranje kuglica, zatim stlačite P3 (= 0,17 bara) kroz priključak P kako biste pomaknuli reagense u komoru za otpad.Na sl.Slika 4b,c prikazuje korake pranja za uklanjanje nečistoća iz uzorka kako slijedi: (1) Otopina za pranje A iz komore W1 ispušta se u komoru za miješanje pod pritiskom P1.(2) Zatim izvršite proces miješanja s mjehurićima.(3) Otopina za pranje A prenosi se u komoru za otpadnu tekućinu, a mikrozrnca iz komore za miješanje izvlače magnet.Ispiranje W (slika 4c) bilo je slično ispiranju A (slika 4b).Treba napomenuti da je svaki korak pranja A i W izveden dva puta.Slika 4d prikazuje korake eluiranja za eluiranje RNA iz kuglica;koraci eluiranja i uvođenja miješanja su isti kao gore opisani koraci adsorpcije RNA i ispiranja.Kako se reagensi za eluiranje prenose u PCR reakcijsku komoru pod tlakom P3 i P4 (=0,23 bara), kritični tlak se postiže za brtvljenje kraka PCR reakcijske komore.Slično tome, tlak P4 također pomaže u brtvljenju prolaza do komore za otpad.Stoga su svi reagensi za eluiranje ravnomjerno raspoređeni među četiri PCR reakcijske komore kako bi se pokrenule multipleksne PCR reakcije.Gore navedeni postupak predstavljen je u dodatnom filmu S6.
U koraku adsorpcije RNA, uzorak se uvodi u ulaz M i ubrizgava u komoru za miješanje zajedno s prethodno pohranjenom otopinom kuglica.Nakon miješanja i uklanjanja granula, reagensi se raspoređuju u komoru za otpad.b i c korake ispiranja, unesite različite prethodno pohranjene reagense za ispiranje u komoru za miješanje i nakon miješanja i uklanjanja kuglica, prenesite reagense u komoru za otpadnu tekućinu.d Korak eluiranja: Nakon unošenja reagensa za eluiranje, miješanja i ekstrakcije kuglica, reagensi se prenose u PCR reakcijsku komoru.Krivulje pokazuju tijek rada i povezane parametre različitih faza.Tlak je tlak koji djeluje kroz pojedinačne komore.Volumen je volumen tekućine u komori za miješanje.Sve skale su 1 cm.Neobrađeni podaci daju se kao datoteke neobrađenih podataka.
Proveden je postupak PCR testiranja i dopunska slika S7 predstavlja toplinske profile uključujući 20 minuta vremena obrnute transkripcije i 60 minuta vremena termičkog ciklusa (95 i 60 °C), pri čemu jedan termalni ciklus iznosi 90 s (dodatni film S7)..FAST-POCT zahtijeva manje vremena za dovršetak jednog toplinskog ciklusa (90 sekundi) nego konvencionalni RT-PCR (180 sekundi za jedan termalni ciklus).To se može objasniti visokim omjerom površine i volumena i niskom toplinskom inercijom mikro-PCR reakcijske komore.Površina komore je 96,6 mm2, a volumen komore je 25 mm3, što čini omjer površine i volumena približno 3,86.Kao što se vidi na dodatnoj slici S10, područje PCR testa naše platforme ima utor na stražnjoj ploči, zbog čega je dno PCR komore debelo 200 µm.Toplinski provodljiva elastična podloga pričvršćena je na grijaću površinu regulatora temperature, osiguravajući tijesan kontakt sa stražnjom stranom ispitne kutije.To smanjuje toplinsku inerciju platforme i poboljšava učinkovitost grijanja/hlađenja.Tijekom toplinskog ciklusa, parafin ugrađen u platformu se topi i teče u PCR reakcijsku komoru, djelujući kao brtvilo za sprječavanje isparavanja reagensa i kontaminacije okoliša (pogledajte Dodatni film S8).
Svi gore opisani procesi detekcije PCR-a potpuno su automatizirani korištenjem instrumenta FAST-POCT izrađenog po narudžbi, koji se sastoji od programirane jedinice za kontrolu tlaka, jedinice za magnetsku ekstrakciju, jedinice za kontrolu temperature i jedinice za hvatanje i obradu fluorescentnog signala.Treba napomenuti da smo koristili platformu FAST-POCT za izolaciju RNK, a zatim smo upotrijebili ekstrahirane uzorke RNK za PCR reakcije koristeći FAST-POCT sustav i stolni PCR sustav za usporedbu.Rezultati su bili gotovo isti kao što je prikazano na dodatnoj slici S8.Operater obavlja jednostavan zadatak: uvodi uzorak u M-komoru i umeće platformu u instrument.Kvantitativni rezultati testa dostupni su za oko 82 minute.Detaljne informacije o FAST-POCT alatima mogu se pronaći na dodatnoj slici.C9, C10 i C11.
Gripa uzrokovana virusima influence A (IAV), B (IBV), C (ICV) i D (IDV) čest je globalni fenomen.Od toga su IAV i IBV odgovorni za najteže slučajeve i sezonske epidemije, zaraze 5-15% svjetske populacije, uzrokuju 3-5 milijuna teških slučajeva i uzrokuju 290 000-650 000 smrti godišnje.Bolesti dišnog sustava56,57.Rana dijagnoza IAV i IB je ključna za smanjenje morbiditeta i povezanog ekonomskog opterećenja.Među dostupnim dijagnostičkim tehnikama, lančana reakcija polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i najtočnijom (>99%)58,59.Među dostupnim dijagnostičkim tehnikama, lančana reakcija polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i najtočnijom (>99%)58,59.Među dostupnim dijagnostičkim metodama polimerazna reakcija s obratnom transkriptazom (OT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i točnom (> 99%)58,59.Među dostupnim dijagnostičkim metodama, lančana reakcija polimerazom reverzne transkriptaze (RT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i najtočnijom (> 99%)58,59. Od dostupnih dijagnostičkih metoda polimerazna reakcija s obratnom transkriptazom (OT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i točnom (>99%)58,59.Od dostupnih dijagnostičkih metoda, lančana reakcija polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i najtočnijom (>99%)58,59.Međutim, tradicionalne RT-PCR metode zahtijevaju opetovano pipetiranje, miješanje, doziranje i prijenos tekućine, ograničavajući njihovu upotrebu od strane profesionalaca u okruženjima s ograničenim resursima.Ovdje je platforma FAST-POCT korištena za PCR detekciju IAV odnosno IBV, kako bi se dobila njihova donja granica detekcije (LOD).Osim toga, IAV i IBV su multipleksirani kako bi razlikovali različite patotipove među vrstama, pružajući obećavajuću platformu za genetsku analizu i mogućnost točnog liječenja bolesti.
Na sl.Slika 5a prikazuje rezultate HAV PCR testiranja korištenjem 150 µl pročišćene virusne RNA kao uzorka.Na sl.Slika 5a(i) pokazuje da pri koncentraciji HAV od 106 kopija/ml, intenzitet fluorescencije (ΔRn) može doseći 0,830, a kada se koncentracija smanji na 102 kopije/ml, ΔRn još uvijek može doseći 0,365, što odgovara višem od skupine prazne negativne kontrole (0,002), oko 100 puta više.Za kvantifikaciju temeljenu na šest neovisnih eksperimenata, generirana je linearna kalibracijska krivulja između logaritemske koncentracije i praga ciklusa (Ct) IAV (Slika 5a(ii)), R2 = 0,993, u rasponu od 102-106 kopija/mL.rezultati se dobro slažu s konvencionalnim RT-PCR metodama.Na sl.Slika 5a(iii) prikazuje fluorescentne slike rezultata testa nakon 40 ciklusa FAST-POCT platforme.Otkrili smo da platforma FAST-POCT može detektirati HAV već od 102 kopije/mL.Međutim, tradicionalna metoda nema Ct vrijednost od 102 kopije/mL, što je LOD čini oko 103 kopije/mL.Pretpostavili smo da bi to moglo biti zbog visoke učinkovitosti miješanja mjehurića.Eksperimenti s PCR testom provedeni su na pročišćenoj IAV RNA kako bi se procijenile različite metode miješanja, uključujući miješanje mućkanjem (ista metoda miješanja kao u konvencionalnoj RT-PCR operaciji), miješanje u bočici (ova metoda, 3 s pri 0,12 bara) i bez miješanja kao kontrolna skupina ..Rezultati se mogu pronaći na dodatnoj slici S12.Može se vidjeti da su pri višoj koncentraciji RNA (106 kopija/mL), Ct vrijednosti različitih metoda miješanja gotovo iste kao kod miješanja s mjehurićima.Kada je koncentracija RNA pala na 102 kopije/mL, mješavina za protresanje i kontrole nisu imale vrijednosti Ct, dok je metoda miješanja s mjehurićima i dalje davala vrijednost Ct od 36,9, što je bilo ispod praga Ct od 38. Rezultati pokazuju dominantnu karakteristiku miješanja vezikule, što je također dokazano u drugoj literaturi, što također može objasniti zašto je osjetljivost platforme FAST-POCT nešto veća od konvencionalne RT-PCR.Na sl.Slika 5b prikazuje rezultate PCR analize pročišćenih uzoraka IBV RNA u rasponu od 101 do 106 kopija/ml.Rezultati su bili slični IAV testu, postižući R2 = 0,994 i LOD od 102 kopije/mL.
PCR analiza virusa influence A (IAV) s koncentracijama IAV u rasponu od 106 do 101 kopija/mL korištenjem TE pufera kao negativne kontrole (NC).(i) Krivulja fluorescencije u stvarnom vremenu.(ii) Linearna kalibracijska krivulja između logaritamske koncentracije IAV RNA i praga ciklusa (Ct) za FAST i konvencionalne metode ispitivanja.(iii) IAV FAST-POCT fluorescentna slika nakon 40 ciklusa.b, PCR detekcija virusa influence B (IBV) s (i) spektrom fluorescencije u stvarnom vremenu.(ii) Linearna kalibracijska krivulja i (iii) FAST-POCT IBV fluorescentna slika nakon 40 ciklusa.Donja granica detekcije (LOD) za IAV i IBV korištenjem platforme FAST-POCT bila je 102 kopije/mL, što je niže od konvencionalnih metoda (103 kopije/mL).c Rezultati testa multipleksa za IAV i IBV.GAPDH je korišten kao pozitivna kontrola, a TE pufer je korišten kao negativna kontrola kako bi se spriječila moguća kontaminacija i pozadinsko pojačanje.Mogu se razlikovati četiri različite vrste uzoraka: (1) negativni uzorci samo za GAPDH ("IAV-/IBV-");(2) IAV infekcija ("IAV+/IBV-") s IAV i GAPDH;(3) IBV infekcija ("IAV-/IBV+") s IBV i GAPDH;(4) Infekcija IAV/IBV ("IAV+/IBV+") s IAV, IBV i GAPDH.Isprekidana linija predstavlja liniju praga.Provedeno je n = 6 biološki neovisnih eksperimenata, podaci su prikazani kao ± standardna devijacija.Neobrađeni podaci prikazuju se kao datoteke neobrađenih podataka.
Na sl.Slika 5c prikazuje rezultate testa multipleksiranja za IAV/IBV.Ovdje je virusni lizat korišten kao otopina uzorka umjesto pročišćene RNA, a četiri početnice za IAV, IBV, GAPDH (pozitivna kontrola) i TE pufer (negativna kontrola) dodane su u četiri različite reakcijske komore FAST-POCT platforme.Ovdje se koriste pozitivne i negativne kontrole kako bi se spriječila moguća kontaminacija i poboljšanje pozadine.Testovi su podijeljeni u četiri skupine: (1) GAPDH-negativni uzorci (“IAV-/IBV-”);(2) Inficirani IAV-om ("IAV+/IBV-") u odnosu na IAV i GAPDH;(3) IBV-.zaraženi (“IAV-”) -/IBV+”) IBV i GAPDH;(4) IAV/IBV ("IAV+/IBV+") infekcija s IAV, IBV i GAPDH.Na sl.Slika 5c pokazuje da kada su primijenjeni negativni uzorci, intenzitet fluorescencije ΔRn komore pozitivne kontrole bio je 0,860, a ΔRn IAV i IBV bio je sličan negativnoj kontroli (0,002).Za skupine IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ i IAV+/IBV+, kamere IAV/GAPDH, IBV/GAPDH i IAV/IBV/GAPDH pokazale su značajan intenzitet fluorescencije, dok su ostale kamere čak pokazale intenzitet fluorescencije u pozadini razina 40 nakon toplinskog ciklusa.Iz gore navedenih testova, platforma FAST-POCT pokazala je izvanrednu specifičnost i omogućila nam da simultano patotipiziramo različite viruse influence.
Kako bismo potvrdili kliničku primjenjivost FAST-POCT-a, testirali smo 36 kliničkih uzoraka (uzorci briseva nosa) pacijenata s IB-om (n=18) i kontrola bez IB-a (n=18) (Slika 6a).Podaci o pacijentima prikazani su u Dodatnoj tablici 3. Status infekcije IB-om je neovisno potvrđen, a protokol studije odobrila je Prva pridružena bolnica Sveučilišta Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang).Svaki uzorak pacijenata podijeljen je u dvije kategorije.Jedan je obrađen pomoću FAST-POCT-a, a drugi je obrađen pomoću desktop PCR sustava (SLAN-96P, Kina).Oba testa koriste iste komplete za pročišćavanje i detekciju.Na sl.Slika 6b prikazuje rezultate FAST-POCT i konvencionalne PCR reverzne transkripcije (RT-PCR).Usporedili smo intenzitet fluorescencije (FAST-POCT) s -log2(Ct), gdje je Ct prag ciklusa za konvencionalni RT-PCR.Postojalo je dobro slaganje između dviju metoda.FAST-POCT i RT-PCR pokazali su jaku pozitivnu korelaciju s vrijednošću Pearsonovog omjera (r) od 0,90 (Slika 6b).Zatim smo procijenili dijagnostičku točnost FAST-POCT-a.Distribucije intenziteta fluorescencije (FL) za pozitivne i negativne uzorke dane su kao neovisna analitička mjera (slika 6c).Vrijednosti FL bile su značajno više u bolesnika s IB-om nego u kontrolnih skupina (****P = 3,31 × 10-19; dvostrani t-test) (slika 6d).Zatim su iscrtane krivulje radnih karakteristika IBV prijemnika (ROC).Utvrdili smo da je dijagnostička točnost bila vrlo dobra, s površinom ispod krivulje 1 (slika 6e).Imajte na umu da zbog obveznog naručivanja maski u Kini zbog bolesti COVID-19 od 2020. nismo identificirali pacijente s IBD-om, tako da su svi pozitivni klinički uzorci (tj. uzorci briseva nosa) bili samo za IBV.
Dizajn kliničke studije.Ukupno 36 uzoraka, uključujući 18 uzoraka pacijenata i 18 kontrola bez gripe, analizirano je pomoću platforme FAST-POCT i konvencionalne RT-PCR.b Procijenite analitičku dosljednost između FAST-POCT PCR i konvencionalne RT-PCR.Rezultati su bili u pozitivnoj korelaciji (Pearson r = 0,90).c Razine intenziteta fluorescencije u 18 bolesnika s IB-om i 18 kontrolnih skupina.d U bolesnika s IB (+), vrijednosti FL bile su značajno više nego u kontrolnoj skupini (-) (****P = 3,31 × 10-19; dvostrani t-test; n = 36).Za svaki kvadratni dijagram, crni marker u sredini predstavlja medijan, a donja i gornja linija okvira predstavljaju 25. odnosno 75. percentil.Brkovi se protežu do minimalnih i maksimalnih podatkovnih točaka, koje se ne smatraju ekstremima.e ROC krivulja.Isprekidana linija d predstavlja vrijednost praga procijenjenu iz ROC analize.AUC za IBV je 1. Neobrađeni podaci daju se kao datoteke s neobrađenim podacima.
U ovom članku predstavljamo FAST, koji ima karakteristike potrebne za idealan POCT.Prednosti naše tehnologije uključuju: (1) Svestrano doziranje (kaskadno, simultano, sekvencijalno i selektivno), otpuštanje na zahtjev (brzo i proporcionalno otpuštanje primijenjenog tlaka) i pouzdan rad (vibracija na 150 stupnjeva) (2) dugotrajno skladištenje (2 godine ubrzanog testiranja, gubitak težine oko 0,3%);(3) sposobnost rada s tekućinama širokog raspona močivosti i viskoznosti (viskoznost do 5500 cP);(4) Ekonomičan (Procijenjeni materijalni trošak FAST-POCT PCR uređaja je približno 1 USD).Kombinacijom višenamjenskih dispenzera demonstrirana je i primijenjena integrirana FAST-POCT platforma za PCR detekciju virusa influence A i B.FAST-POCT traje samo 82 minute.Klinički testovi s 36 uzoraka briseva nosa pokazali su dobru podudarnost intenziteta fluorescencije sa standardnom RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).Klinički testovi s 36 uzoraka briseva nosa pokazali su dobru podudarnost intenziteta fluorescencije sa standardnom RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).Klinički testovi s 36 uzoraka mazkova iz nosa pokazali su dobru usklađenost intenziteta fluorescencije standardnog OT-PCR (Pirsonov koeficijent > 0,9).Klinički testovi s 36 uzoraka briseva nosa pokazali su dobro slaganje s intenzitetom fluorescencije standardne RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).RT-PCR Kliničeskoe ispitivanje 36 uzoraka mazkova iz nosa pokazalo je dobro smanjenje intenziteta fluorescencije prema standardnom OT-PCR (Pirsonov koeficijent > 0,9).Kliničko ispitivanje 36 uzoraka briseva nosa pokazalo je dobro slaganje intenziteta fluorescencije sa standardnom RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).Paralelno s ovim radom, razne biokemijske metode u nastajanju (npr. toplinski ciklus plazme, imunotestovi bez amplifikacije i testovi funkcionalizacije nanotijela) pokazali su svoj potencijal u POCT-u.Međutim, zbog nedostatka potpuno integrirane i robusne POCT platforme, ove metode neizbježno zahtijevaju zasebne postupke prethodne obrade (npr. izolaciju RNK44, inkubaciju45 i ispiranje46), što dodatno nadopunjuje trenutni rad s ovim metodama za implementaciju naprednih POCT funkcija s tražene parametre.izvedba dohvaćanja-odgovora-izlaza.U ovom radu, iako je zračna pumpa koja se koristi za aktiviranje FAST ventila dovoljno mala da se integrira u stacionarni instrument (sl. S9, S10), ona i dalje troši značajnu snagu i stvara buku.U principu, pneumatske pumpe manjeg oblika mogu se zamijeniti drugim sredstvima, kao što je upotreba elektromagnetske sile ili aktiviranje prstom.Daljnja poboljšanja mogu uključivati, na primjer, prilagodbu kompleta za različite i specifične biokemijske testove, koristeći nove metode detekcije koje ne zahtijevaju sustave grijanja/hlađenja, čime se osigurava POCT platforma bez alata za PCR aplikacije.Vjerujemo da s obzirom na to da FAST platforma pruža način za manipulaciju tekućinama, vjerujemo da predložena FAST tehnologija predstavlja potencijal za stvaranje zajedničke platforme ne samo za biomedicinska ispitivanja, već i za praćenje okoliša, ispitivanje kvalitete hrane, sintezu materijala i lijekova ..
Prikupljanje i korištenje uzoraka briseva nosa ljudi odobrilo je Etičko povjerenstvo prve pridružene bolnice Sveučilišta Zhejiang (IIT20220330B).Prikupljeno je 36 uzoraka briseva nosa, od kojih je sudjelovalo 16 odraslih osoba < 30 godina, 7 odraslih osoba > 40 godina te 19 muškaraca i 17 žena.Prikupljeno je 36 uzoraka briseva nosa, od kojih je sudjelovalo 16 odraslih osoba < 30 godina, 7 odraslih osoba > 40 godina te 19 muškaraca i 17 žena.Sakupljeno je 36 uzoraka mazkova iz nosa, u kojima je sudjelovalo 16 odraslih < 30 godina, 7 odraslih starijih od 40 godina, 19 muškaraca i 17 žena.Trideset i šest uzoraka brisa nosa prikupljeno je od 16 odraslih osoba < 30 godina starosti, 7 odraslih osoba starijih od 40 godina, 19 muškaraca i 17 žena.Demografski podaci prikazani su u Dodatnoj tablici 3. Informirani pristanak dobiven je od svih sudionika.Svi sudionici su bili pod sumnjom na gripu te su se dobrovoljno testirali bez naknade.
Baza i poklopac FAST izrađeni su od polilaktične kiseline (PLA) i ispisani su pomoću 3D pisača Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Dvostrana traka je kupljena od Adhesives Research, Inc. Model 90880. PET film debljine 100 um je kupljen od McMaster-Carr.I ljepilo i PET film izrezani su pomoću rezača Silhouette Cameo 2 tvrtke Silhouette America, Inc. Elastični film izrađen je od PDMS materijala injekcijskim prešanjem.Prvo je laserskim sustavom izrezan PET okvir debljine 200 µm i zalijepljen na 3 mm debelu PMMA ploču pomoću 100 µm dvostrano ljepljive trake.PDMS prekursor (Sylgard 184; Dio A: Dio B = 10:1, Dow Corning) je zatim izliven u kalup i staklena šipka je korištena za uklanjanje viška PDMS.Nakon stvrdnjavanja na 70°C tijekom 3 sata, PDMS film debljine 300 μm mogao se odlijepiti s kalupa.
Fotografije za svestranu distribuciju, objavljivanje na zahtjev i pouzdanu izvedbu snimaju se kamerom velike brzine (Sony AX700 1000 fps).Orbitalna mućkalica korištena u testu pouzdanosti kupljena je od SCILOGEX (SCI-O180).Tlak zraka stvara zračni kompresor, a nekoliko digitalnih preciznih regulatora tlaka koristi se za podešavanje vrijednosti tlaka.Postupak ispitivanja ponašanja protoka je sljedeći.Unaprijed određena količina tekućine ubrizgana je u ispitni uređaj i korištena je kamera velike brzine za snimanje ponašanja protoka.Fotografije su zatim uzete iz videozapisa ponašanja protoka u fiksnim vremenima, a preostala površina izračunata je pomoću softvera Image-Pro Plus, koji je zatim pomnožen s dubinom kamere kako bi se izračunao volumen.Pojedinosti o sustavu ispitivanja ponašanja protoka mogu se pronaći na dodatnoj slici S4.
Ubrizgajte 50 µl mikrokuglica i 100 µl deionizirane vode u uređaj za miješanje bočice.Fotografije mješovite izvedbe snimljene su kamerom velike brzine svakih 0,1 sekundu pri tlaku od 0,1 bara, 0,15 bara i 0,2 bara.Informacije o pikselima tijekom procesa miješanja mogu se dobiti iz ovih slika pomoću softvera za obradu fotografija (Photoshop CS6).Učinkovitost miješanja može se postići sljedećom jednadžbom 53.
gdje je M učinkovitost miješanja, N ukupan broj piksela uzorka, a ci i \(\bar{c}\) su normalizirane i očekivane normalizirane koncentracije.Učinkovitost miješanja kreće se od 0 (0%, nepomiješano) do 1 (100%, potpuno izmiješano).Rezultati su prikazani na dodatnoj slici S6.
Komplet RT-PCR u stvarnom vremenu za IAV i IBV, uključujući IAV i IBV RNA uzorke (kat. br. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Kina), Tris-EDTA pufer (TE pufer br. B541019 , Sangon Biotech, Kina), Komplet za pročišćavanje RNK pozitivne kontrole (Br. dijela Z-ME-0010, Liferiver, Kina) i Otopina GAPDH (Br. dijela M591101, Sangon Biotech, Kina) komercijalno su dostupni.Komplet za pročišćavanje RNA uključuje pufer za vezanje, ispiranje A, ispiranje W, eluens, magnetska mikrozrnca i akrilni nosač.IAV i IBV kompleti za RT-PCR u stvarnom vremenu uključuju IFVA mješavinu za PCR detekciju nukleinske kiseline i RT-PCR enzim.Dodajte 6 µl AcrylCarriera i 20 µl magnetskih kuglica u 500 µl otopine pufera za vezanje, dobro protresite i zatim pripremite otopinu kuglica.Dodati 21 ml etanola u ispiranja A i W, dobro protresti da se dobiju otopine ispiranja A i W.Zatim je 18 µl fluorescentne PCR smjese s IFVA nukleinskom kiselinom i 1 µl RT-PCR enzima dodano u 1 µl TE otopine, protreseno i centrifugirano nekoliko sekundi, dobivajući 20 µl IAV i IBV početnica.
Slijedite sljedeći postupak pročišćavanja RNA: (1) Adsorpcija RNA.Otpipetirajte 526 µl otopine peleta u epruvetu centrifuge od 1,5 ml i dodajte 150 µl uzorka, zatim ručno protresite epruvetu gore-dolje 10 puta.Prenesite 676 µl smjese u afinitetnu kolonu i centrifugirajte na 1,88 x 104 g 60 sekundi.Naknadni odvodi se tada odbacuju.(2) Prva faza pranja.Dodajte 500 µl otopine za ispiranje A u afinitetnu kolonu, centrifugirajte na 1,88 x 104 g 40 s i odbacite istrošenu otopinu.Ovaj postupak pranja je ponovljen dva puta.(3) druga faza pranja.Dodajte 500 µl otopine za ispiranje W u afinitetnu kolonu, centrifugirajte na 1,88 × 104 g 15 s i odbacite istrošenu otopinu.Ovaj postupak pranja je ponovljen dva puta.(4) Ispiranje.Dodajte 200 µl eluata u afinitetnu kolonu i centrifugirajte na 1,88 x 104 g 2 minute.(5) RT-PCR: eluat je ubrizgan u 20 μl otopine primera u PCR epruveti, a zatim je epruveta stavljena u PCR test aparat u stvarnom vremenu (SLAN-96P) kako bi se proveo RT-PCR proces.Cijeli proces detekcije traje otprilike 140 minuta (20 minuta za pročišćavanje RNA i 120 minuta za PCR detekciju).
526 µl otopine kuglica, 1000 µl otopine za ispiranje A, 1000 µl otopine za ispiranje W, 200 µl eluata i 20 µl otopine primera prethodno je dodano i pohranjeno u komorama M, W1, W2, E i PCR detekcijskim komorama.Montaža platforme.Zatim je 150 µl uzorka pipetirano u komoru M, a platforma FAST-POCT umetnuta je u ispitni instrument prikazan na Dodatnoj slici S9.Nakon otprilike 82 minute rezultati testa bili su dostupni.
Osim ako nije drugačije navedeno, svi rezultati testa prikazani su kao srednja vrijednost ± SD nakon najmanje šest ponavljanja koristeći samo platformu FAST-POCT i biološki neovisne uzorke.Nijedan podatak nije isključen iz analize.Eksperimenti nisu slučajni.Istraživači nisu bili slijepi za grupne zadatke tijekom eksperimenta.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak Izvješća o istraživanju prirode povezan s ovim člankom.
Podaci koji podupiru rezultate ove studije dostupni su u Dodatnim informacijama.Ovaj članak daje izvorne podatke.
Chagla, Z. & Madhukar, P. Pojačivači cjepiva protiv COVID-19 u bogatim zemljama odgodit će cjepiva za sve.Chagla, Z. & Madhukar, P. Pojačivači cjepiva protiv COVID-19 u bogatim zemljama odgodit će cjepiva za sve.Chagla, Z. i Madhukar, P. Cjepiva protiv COVID-19 u bogatim zemljama odgodit će cjepiva za sve.Chagla, Z. i Madhukar, P. Ponovno cijepljenje protiv COVID-19 u bogatim zemljama odgodit će cijepljenje za sve.Narodna medicina.27, 1659–1665 (2021).
Faust, L. i sur.Testiranje na SARS-CoV-2 u zemljama s niskim i srednjim dohotkom: dostupnost i pristupačnost u privatnom zdravstvenom sektoru.mikrobna infekcija.22, 511–514 (2020).
Svjetska zdravstvena organizacija.Globalna prevalencija i incidencija odabranih izlječivih spolno prenosivih infekcija: pregled i procjene.Ženeva: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM i sur.Višestruke 2D oblikovane trake za testiranje bočnog protoka.ASS aplikacija.alma mater.Inter Milano.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM et al.Potpuno zatvoreni mikrofluidni uređaj za analizu na papiru.anus.Kemijski.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. i sur.Konkurentna papirnata imunokromatografija u kombinaciji s enzimski modificiranim elektrodama omogućuje bežično praćenje i elektrokemijsko određivanje kotinina u urinu.Senzori 21, 1659 (2021).
Zhu, X. i sur.Kvantificiranje biomarkera bolesti sa svestranom bočnom tekućinskom platformom integriranom u nanozime pomoću glukometra.biološki senzor.Bioelektronika.126, 690–696 (2019).
Boo, S. i sur.Testna traka za trudnoću za otkrivanje patogenih bakterija pomoću konkanavalina A-humanog korionskog gonadotropina-Cu3(PO4)2 hibridnog nanocvijeća, magnetske separacije i očitavanja s pametnog telefona.Mikroračunalo.Časopis.185, 464 (2018).